色譜柱的使用和維護(hù)：液相色譜儀由高壓液壓泵、檢測(cè)器和液相色譜柱組成，其中正確安裝和使用液相色譜柱是液相色譜工作的關(guān)鍵。這也是液相色譜工作者獲得正確可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的必由之路。
為什么要學(xué)習(xí)使用高效液相色譜柱？
色譜柱的使用與維護(hù)：液相色譜儀由高壓液泵、檢測(cè)器和液相色譜柱組成。液相色譜柱的正確安裝和使用是液相色譜工作的關(guān)鍵。這也是液相色譜儀獲得正確可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，建立高效液相色譜儀日常維護(hù)保養(yǎng)規(guī)程，確保正常使用的必由之路。
高效液相色譜柱的適用范圍：
該方法適用于高效液相色譜柱的維護(hù)和維護(hù)。
1.液相色譜柱結(jié)構(gòu)：
主要研究結(jié)果如下：(1)液相色譜柱由柱管、壓力帽、夾套(密封環(huán))、篩板(過(guò)濾器)、接頭、螺釘(頭)和柱填料組成。
柱管：不銹鋼制成，如果柱壓不超過(guò)70 kg/cm2，也可使用厚壁玻璃或石英管，內(nèi)壁要求較高的光潔度。用于柱包裝?？账乃胁考际遣讳P鋼制成的，能夠承受一般溶劑的作用。但由于含氯化物的溶劑對(duì)其有一定的腐蝕性，故使用時(shí)要注意，柱及連接管內(nèi)不能長(zhǎng)時(shí)間存留此類溶劑，以避免腐蝕。壓力帽：一種塑料圓柱形蓋，其兩端包裹在柱端的外墻上，中間有小孔，主要由聚四氟乙烯制成，用于固定篩板。
密封圈：位于連接螺旋環(huán)內(nèi)壁的彈性環(huán)，主要由聚四氟乙烯制成，用來(lái)密封色譜柱兩端的蓋子和色譜柱的外壁。
（2）柱填料：
液相色譜柱在填料和流動(dòng)相之間進(jìn)行分離，并根據(jù)填料的類型對(duì)色譜柱進(jìn)行分類。
正相柱：
它們大多以硅膠作為柱填料。按形貌可分為無(wú)定形和球形，粒徑在3≤10μm范圍內(nèi)。另一種正相填料是硅膠表面鍵合-CN、-NH2等官能團(tuán)，即鍵合相硅膠。
反相柱：
將非極性填料十八烷基官能團(tuán)(ODS)鍵合在硅膠表面。也存在無(wú)定形和球形的差異。
其它常用的反相填料有鍵合C8、C4、C2、苯基等，粒徑在3-10um之間。
2.色譜柱的安裝：
（1）拆下柱填料盒，并確認(rèn)儲(chǔ)存在柱中的類型、大小、出廠日期和溶劑。
（2）擰開(kāi)柱兩端接頭的密封塞，并將其放回包裝盒內(nèi)以作備份。
（3）根據(jù)柱管上指示的流動(dòng)相流向，柱的入口端通過(guò)連接管與注入閥的出口相連（如條件允許，建議在柱前設(shè)置保護(hù)柱）；柱的出口與檢測(cè)器相連。連接管為外徑1.57 mm、內(nèi)徑0.1~0.3 mm的不銹鋼管。連接管兩端有空心螺釘和密封環(huán)。在接管時(shí)一定要設(shè)法降低柱外死體積。連接管通過(guò)空心螺釘、壓環(huán)后盡量用力插到底，然后順時(shí)針擰緊空心螺釘，直到擰不動(dòng)為止。
液相色譜柱的使用
在使用該列之前，好先測(cè)試該列的性能，并將結(jié)果保存起來(lái)，以供將來(lái)評(píng)估該列的性能時(shí)參考。但是，需要注意的是，由于樣品、流動(dòng)相、柱溫等因素的不同，柱的性能可能會(huì)有所不同。此外，柱性能試驗(yàn)是根據(jù)柱工廠報(bào)告中的條件(工廠試驗(yàn)中使用的條件)進(jìn)行的，只有這樣，才能使測(cè)量結(jié)果具有可比性。
1.樣品的前處理：
(1)用流動(dòng)相溶解樣品效果好；
(2)用處理柱去除樣品中的強(qiáng)極性或用柱填料產(chǎn)生不可逆吸附雜質(zhì)；
(3)采用0.45μm濾膜去除顆粒雜質(zhì)；
2.流動(dòng)相的配制：
液相色譜是通過(guò)柱填料和流動(dòng)相之間的質(zhì)量交換對(duì)樣品組分進(jìn)行分離的過(guò)程。因此，流動(dòng)相必須具有以下特性：
主要結(jié)果如下：(1)流動(dòng)相對(duì)于樣品具有一定的溶解度，保證了樣品組分不會(huì)在柱內(nèi)沉淀(或長(zhǎng)時(shí)間保留在柱中)。
(2)流動(dòng)相具有一定的慣性，不與樣品發(fā)生化學(xué)反應(yīng)(特殊情況除外)。
(3)分析柱越長(zhǎng)，流動(dòng)相的粘度越小，分離效果越好，同時(shí)降低柱的壓降，延長(zhǎng)液泵的使用壽命(采用升溫的方法可以降低流動(dòng)相的粘度)。
(4)流動(dòng)相的物理化學(xué)性質(zhì)應(yīng)適合于使用的檢測(cè)器，如使用紫外檢測(cè)器，好采用低紫外吸收的溶劑。
(5)流動(dòng)相沸點(diǎn)不宜過(guò)低，否則易產(chǎn)生氣泡，不能進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
(6)準(zhǔn)備好流動(dòng)相后，必須進(jìn)行除氣。除去溶解在流動(dòng)相中的微量氣體不僅有利于檢測(cè)，而且還可以防止流動(dòng)相和樣品中痕量氧之間的相互作用。
3. 流速的選擇：
由于柱效應(yīng)是柱內(nèi)流動(dòng)相線性流速的函數(shù)，不同流速下可獲得不同的柱效應(yīng)。對(duì)于特定的柱，為了追求的柱效果，好采用流速。對(duì)于內(nèi)徑為4.6mm的柱，流速為1mL/min；內(nèi)徑為4.0mm的柱，流速為0.8mL/min。當(dāng)選擇速度時(shí)，可延長(zhǎng)分析時(shí)間。改變流動(dòng)相洗滌強(qiáng)度的方法可縮短分析時(shí)間(如采用反相柱可適當(dāng)增加甲醇或乙腈的含量)。
4. 流動(dòng)相使用注意事項(xiàng)：
主要結(jié)果如下：(1)由于甲醇價(jià)格低廉，推薦采用甲醇反相柱(乙腈除外)。
(2)正相柱以30℃~60℃的石油醚為流動(dòng)相，正己烷為流動(dòng)相；未經(jīng)凈化的正己烷不能使用。好使用超純水(電阻率大于18兆歐)。去離子水和二次蒸餾水中含有酚類雜質(zhì)，這可能會(huì)影響分析結(jié)果。
(3)以緩沖溶液為流動(dòng)相，在實(shí)驗(yàn)前制備出流動(dòng)相，特別是在夏季。好是添加疊氮化鈉，以防止細(xì)菌的生長(zhǎng)。
(4)流動(dòng)相要求使用0.45μm濾膜去除顆粒雜質(zhì)。
(5)采用高效液相色譜法制備流動(dòng)相，采用合適的流動(dòng)相，可以延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命，提高色譜柱的性能。
液相色譜柱的保存
1.反向色譜柱實(shí)驗(yàn)后的保養(yǎng)：
用含鹽緩沖液或流動(dòng)相后，用10%甲醇/水沖洗30分鐘，洗去色譜柱中的鹽，再用甲醇沖洗30分鐘。注意：不要用純水沖洗塔，應(yīng)在水中加入10%的甲醇，以防止填料倒塌。
2.長(zhǎng)期保存色譜柱：
例如，色譜柱若要長(zhǎng)期保存，必須保存在合適的溶劑中，反相柱可以儲(chǔ)存在純甲醇或乙腈中，正相柱可以儲(chǔ)存在嚴(yán)格脫水的純正己烷中。離子交換柱可以儲(chǔ)存在水中(含防腐劑、疊氮化鈉或硫柳汞)，并在室溫下堵塞插頭。
液相色譜柱的再生
因?yàn)椋V柱是消耗品，隨著使用時(shí)間或進(jìn)樣次數(shù)的增加，會(huì)出現(xiàn)色譜峰高降低，峰寬加大或出現(xiàn)肩峰的現(xiàn)象，一般來(lái)說(shuō)是柱效的下降。
1.反向柱的再生：
色譜柱以甲醇：水=10：90(V/V)為流動(dòng)相，乙腈-異丙醇為流動(dòng)相，色譜柱體積為甲醇：水=10：90(V/V)的20~30倍，流動(dòng)相為乙腈-異丙醇。
2.正相柱的再生：
柱容為20×30倍，異丙醇(異丙醇粘度高，可降低流速，避免壓力過(guò)大)，二氯甲烷、甲醇為流動(dòng)相沖洗柱，然后按反序沖洗。請(qǐng)注意，上述溶劑必須嚴(yán)格脫水。
3.離子交換柱的再生：
在緩沖溶液中長(zhǎng)期使用和進(jìn)樣會(huì)導(dǎo)致色譜柱離子交換容量的下降。陽(yáng)離子柱可以通過(guò)用稀酸緩沖液洗滌來(lái)再生，并且可以通過(guò)用稀堿緩沖液洗滌來(lái)再生陰離子柱。
特別說(shuō)明：
再生過(guò)程中必須隨時(shí)注意塔內(nèi)壓力的變化。過(guò)高的柱壓容易導(dǎo)致硅膠的變形和開(kāi)裂，導(dǎo)致鍵合相極性端鍵合順序的紊亂。同時(shí)，必須確保再生時(shí)間充足。再生時(shí)，好選擇無(wú)在線脫氣的獨(dú)立抽氣系統(tǒng)色譜儀，以防止常相溶劑損壞汽提塔密封膜或儀器精密部件如分子篩、比例閥等。
液相色譜柱常見(jiàn)問(wèn)題分析與解決方案
1.使用一段時(shí)間后柱壓過(guò)高：
解決辦法：首先，檢查HPLC系統(tǒng)的原因是否合理，排除系統(tǒng)原因后，主要原因是實(shí)驗(yàn)過(guò)程中柱中雜質(zhì)的積累。為了盡可能改善操作條件，樣品應(yīng)及時(shí)清洗，如緩沖鹽流動(dòng)相必須用較高比例的水溶液(如90%)清洗，然后用有機(jī)相保存。
2.篩板堵塞與柱頭塌陷：
解決方案：如果確定色譜柱的濾板受到污染，則可用甲醇向相反方向清洗色譜柱至常壓，或?qū)⑸V柱除去，并小心地除去篩板。超聲處理用約5%硝酸溶液處理約20分鐘，然后用純水超聲處理約20分鐘，然后重新裝入色譜柱。
3.色譜柱填料受樣品污染：
解決方法：
如果確定色譜柱填料受到污染，則取下色譜柱螺釘，挖出色譜柱前部受污染的填料，再用相同的色譜柱填料填充。仔細(xì)修理后，重新安裝上柱螺釘。
4。色譜柱中的緩沖液中的鹽遇到高濃度的甲醇或其他有機(jī)溶劑，從而導(dǎo)致結(jié)晶和沉淀：
解決方法：
若確定為鹽結(jié)晶，用10%甲醇/水沖洗柱，溶解全部鹽，然后改變高濃度甲醇。
注意事項(xiàng)：
1。在任何時(shí)候，都要保證色譜柱床不會(huì)干涸，特別是在進(jìn)樣檢測(cè)和柱清洗過(guò)程中，流動(dòng)相不能長(zhǎng)時(shí)間倒空(30min以上)，否則很容易使色譜柱干涸，產(chǎn)生大量難以排出的氣泡。甚至導(dǎo)致柱床中部局部坍塌或開(kāi)裂。
2。使用和保存時(shí)，嚴(yán)禁用力拋擲，絕對(duì)杜絕粗心猛烈撞擊或從高處摔下，否則極易對(duì)柱床造成機(jī)械損傷，無(wú)再生的可能。
3。當(dāng)柱和色譜儀連接時(shí)，必須清洗閥門部分或管道；
4。避免使用高粘度溶劑作為流動(dòng)相；
5.進(jìn)樣樣品要全溶解；
6.大多數(shù)反相色譜柱的pH穩(wěn)定范圍是2～7.5，盡量不超過(guò)該色譜柱的pH范圍；
7。在日常分析工作結(jié)束時(shí)，清洗注入閥中剩余的樣品；
8。在每天的分析和測(cè)定結(jié)束時(shí)，應(yīng)使用適當(dāng)?shù)娜軇?duì)色譜柱進(jìn)行清洗。
9。如果分析柱長(zhǎng)時(shí)間不使用，則應(yīng)用適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑進(jìn)行保存和密封。
